Метод микроспектрофотометрии

Метод микроспектрофотометрии — изящный прием определения спектрального поглощения пигментов in situ. Именно этим методом недавно впервые были определены кривые погло-: щения колбочковых зрительных пигментов человека. Он заключается в том, что с помощью микроспектрофотометра измеряют спектральное поглощение отдельного фоторецептора непосредственно в живой сетчатке. Диаметр светочувствительного элемента фоторецептора составляет всего несколько микрометров, у насекомых диаметр рабдомера равен 0,5—2,0 мкм — отсюда трудность использования метода, так как требуется сфокусировать свет строго на одном рабдомере, а не на нескольких.
Наиболее надежен в отношении изучения спектральной чувствительности сетчатки метод мелькающей колориметрии, или метод нуль-установки, посредством которого судят о числе светоприемников по числу базисных (основных) излучений, необходимых и достаточных для воспроизведения в смеси друг с другом всех спектральных цветов. Он основан на подборе визуальных цветовых равенств (тождеств) и измерении энергии отдельных их компонентов: базисных и монохроматических излучений. В разработке его большую роль сыграл выдающийся отечественный специалист в области физиологической оптики проф. Н. Д. Нюберг. Эксперимент ведется на колориметре замещения, позволяющем быстро заменить монохроматическое излучение на смесь базисных цветов и наоборот. Критерием тождественности для насекомого каждого монохроматического излучения подобранной смеси базисных цветов принимают отсутствие ЭРГ в момент их замены друг на друга. Сама возможность такой подмены, остающейся незамеченной глазом, служит доказательством объективности и надежности метода.
Величину отношения энергии (в процентах от максимума) каждого базисного цвета в их смесях друг с другом к энергии каждого визуально тождественного этим смесям монохроматического цвета (Е%) изображают в виде так называемых кривых сложения базисных цветов. Кривые сложения характеризуют с точностью до их линейной комбинации спектральную чувствительность каждого светоприемника. Если видимый глазом спектр имеет одномерные — монохроматические — области, где работает по одному светоприемнику, то кривые сложения базисных цветов легко пересчитать непосредственно в кривые спектральной чувствительности светоприемников.
Колориметрический метод рассчитан не на определение зрительных пигментов сетчатки, а только на то, чтобы непосредственно найти число фактически работающих в глазу светоприемников и определить их спектральную чувствительность. Иными словами, он более других методов адекватен задачам описания светоприемников сетчатки и измерения многообразия цветов, различимых глазом. Именно колориметрические измерения послужили в свое время математику Грассману экспериментальной основой для выведения трех известных законов оптического смешения цветов для человеческого глаза.
Зрительные пигменты. Зрительный акт начинается с момента поглощения фотонов зрительным пигментом фоторецептора. Молекула фотопигмента состоит из двух непременных частей: прозрачной белковой — о пси на и красящего хромофора — ретин а л я, представляющего собой альдегид витамина Ai или Аг. Под действием поглощенного кванта света молекула пигмента фотоизоме-ризуется: переход из цис- в трансконфигурацию. В этом и состоит единственная роль поглощаемого фотона, так как все дальнейшие реакции в фоторецепторе уже не зависят от наличия света. Чтобы вызвать посредством фотоизомеризации пигмента реакцию зрительной клетки, достаточно хотя.бы одного кванта света.
Зрительных пигментов насекомых известно пока немного, что связано с трудностями их выделения и идентификации. Например, чтобы извлечь зрительный пигмент у медоносной пчелы, американскому исследователю Т. Голдсмису (1958) пришлось, измельчить 20 тыс. голов этого насекомого. Экстрагируют фотопигменты насекомых, обычно дигитаниновым -раствором в нейтральном фосфатном буфере. Чаще всего у насекомых встречаются фотопигменты типа родопсина (палочкового пигмента позвоночных) с Атах между 440—510 нм и вторым пиком поглощения в ультрафиолетовыл лучах. Например, для мух характерен родопсин с Лтах = 495 им. Фотохимический цикл его превращения может быть описан как -Р495«гМ580: нативный пигмент /495 под действием света переходит в термостабильный фотопродукт — метародопсин М580, который регенерирует в исходный пигмент не только в темноте, но и под действием света, в особенности желтого. В глазу, адаптированном к обычному «белому» свету, между Р495 и количеством М580 устанавливается фотохимическое равновесие. Видимо, особый зрительный пигмент, чувствительный в основном к ультрафиолету, свойствен только насекомым. Такой фотопигмент с \пах =345 нм извлечен из головы булавоуски Ascataphus maca-ronius и некоторых других насекомых.







Материалы

Яндекс.Метрика